血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

　　1.化学法

　　化学法一般包括：①抽提;②皂化;③毛地黄皂苷沉淀纯化;④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。

　　2.酵法测定

　　CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。

　　一、Abell-Kendall改良法

　　1.原理

　　血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

　　2.试剂组成

　　代号种类浓度组　成贮存2～8℃有效时间

　　R1乙醇　优质纯

　　R2石油醚　沸点68℃，特级纯

　　R3水醋酸　分析纯

　　R4无水醋酸　胆固醇分析用，不含HCI

　　R5浓硫酸　分析纯

　　R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O20ml

　　R7乙醇性KOH液　R194ml+R66ml　临用前配制

　　R8Liebermann　　　配制后

　　Burchard　R420体积+R51体积+R310体积　1h

　　试剂*　　　内用完

　　R9胆固醇标准液5.17mmol/L胆固醇标准品200mg+R1→100ml0

　　*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。

　　3.操作

　　图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图

　　按图15-1操作。

　　4.计算

　　标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

　　二、酶法(CEH、COD-POD法)

　　首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下，生成红色醌亚胺色素。

　　H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

　　(一)手工测定法

　　1.试剂组成

　　代号种类浓度组成贮2～8℃有效时间

　　Na2HPO450mmol/L

　　Na2H2PO450mmol/L

　　胆酸钠3mmol/L

　　4-氨基安替比林0.82mmol/L

　　R1*ESPAS14mmol/L　　24h

　　Carbowax-60000.17mmol/L

　　CEH33U/L

　　COD117U/L

　　POD6700U/L

　　R2标准液5.17mmol/L用异丙醇溶解胆固醇

　　*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

　　2.操作

　　按图15-2操作。

　　3.计算

　　标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

　　(二)自动化分析仪测定

　　以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

　　1.试剂组成

　　A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

　　B液：COD、4-氨基安替比林等。

　　图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图

　　2.上机参数

　　项　目参　数

　　方　法终点法

　　波　长双波长(540nm，700nm)

　　反应温度37℃

　　试剂A反应时间2～3min

　　试剂B反应时间5～6min

　　样本用量3μl

　　试剂A用量250μl

　　试剂B用量120μl

　　单位mmol/L

　　3.操作过程

　　4.计算

　　以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。

　　5.注意事项

　　(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

　　(2)试剂在有效内2～8℃避光食保存。

　　(3)胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。