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第一节 胆固醇测定

《动脉粥样硬化》

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  血清中胆固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

  1.化学法

  化学法一般包括:①抽提;②皂化;③毛地黄皂苷沉淀纯化;④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法,通过①~④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以引用。

  2.酵法测定

  CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法,快速准确,标本用量少,便于自动生化分析仪作批量测定。

  一、Abell-Kendall改良法

  1.原理

  血清加入醇溶性氢氧化钾,使胆固醇从脂蛋白中分离出来,同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇,加石油醚振摇、抽提,使胆固醇移入石油醚层,分离并取一定量的石油醚层,蒸发至干,再进行Liebermann-Burchard 显色反应,620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

  2.试剂组成

  代号种类浓度组 成贮存2~8℃有效时间

  R1乙醇 优质纯

  R2石油醚 沸点68℃,特级纯

  R3水醋酸 分析纯

  R4无水醋酸 胆固醇分析用,不含HCI

  R5浓硫酸 分析纯

  R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O20ml

  R7乙醇性KOH液 R194ml+R66ml 临用前配制

  R8Liebermann   配制后

  Burchard R420体积+R51体积+R310体积 1h

  试剂*   内用完

  R9胆固醇标准液5.17mmol/L胆固醇标准品200mg+R1→100ml0

  *:在三角烧瓶内,加入无水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入浓硫酸,混合,静置10min,又加冰醋酸混匀,备用。

  3.操作

  图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图

  按图15-1操作。

  4.计算

  标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

  二、酶法(CEH、COD-POD法)

  首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸,胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-胆甾烯酮和H2O2,再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下,生成红色醌亚胺色素。

  H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

  (一)手工测定法

  1.试剂组成

  代号种类浓度组成贮2~8℃有效时间

  Na2HPO450mmol/L

  Na2H2PO450mmol/L

  胆酸钠3mmol/L

  4-氨基安替比林0.82mmol/L

  R1*ESPAS14mmol/L  24h

  Carbowax-60000.17mmol/L

  CEH33U/L

  COD117U/L

  POD6700U/L

  R2标准液5.17mmol/L用异丙醇溶解胆固醇

  *混匀,调pH至6.70±0.10(25℃),或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

  2.操作

  按图15-2操作。

  3.计算

  标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

  (二)自动化分析仪测定

  以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

  1.试剂组成

  A液:CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

  B液:COD、4-氨基安替比林等。

  图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图

  2.上机参数

  项 目参 数

  方 法终点法

  波 长双波长(540nm,700nm)

  反应温度37℃

  试剂A反应时间2~3min

  试剂B反应时间5~6min

  样本用量3μl

  试剂A用量250μl

  试剂B用量120μl

  单位mmol/L

  3.操作过程

  4.计算

  以△A=A2-A1,根据同样处理之标准或质控物计算,打印结果。

  5.注意事项

  (1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

  (2)试剂在有效内2~8℃避光食保存。

  (3)胆固醇含量超过200mmol/L,需用生理盐水稀释再测。

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